Di Stefano, chiamato dagli amici Pippo, ha avuto una brillante carriera che si è protratta dagli anni quaranta fino all'inizio dei settanta. Figlio unico di un calzolaio, carabiniere in congedo, e di una sarta, Giuseppe Di Stefano era stato educato in un seminario dei Gesuiti, e per qualche tempo aveva meditato di avvicinarsi al sacerdozio.
Iniziò la sua carriera di cantante, cimentandosi nella musica leggera cantando con lo pseudonimo di Nino Florio. Allievo del baritono Montesanto, dopo una breve esperienza di cantante a Ginevra, in Svizzera, debuttò ufficialmente nel 1946 a Reggio Emilia interpretando il ruolo di Des Grieux nella Manon di Massenet. Con il medesimo ruolo, avvenne il debutto l'anno successivo al Teatro alla Scala di Milano.Appena un anno dopo, avvenne il debutto al Teatro Metropolitan di New York, quale Duca di Mantova nel Rigoletto di Verdi. Questo importante ruolo fu ricoperto da Di Stefano, sempre al Metropolitan, per diversi anni.Risale invece al 1957 l'esordio in suolo britannico dove, al Festival lirico di Edimburgo, interpretò il ruolo di Nemorino nell'Elisir d'amore di Donizetti. Quattro anni dopo, il palcoscenico del Covent Garden di Londra lo avrebbe visto impegnato nella parte di Mario Cavaradossi nella pucciniana Tosca.
Di Stefano è stato apprezzato in particolare per la purezza della sua voce, il modo interpretativo accattivante e, soprattutto, per la grande presenza scenica. Per oltre venti anni ha calcato i palcoscenici più famosi del mondo. La voce chiara e una spiccata sensibilità interpretativa gli hanno consentito di ricoprire oltre cento ruoli da protagonista.
Generoso e istintivo, ha abbracciato un repertorio molto vasto, che va dal lirico puro dei primi anni, come Des Grieux nella Manon di Jules Massenet o Arturo ne I Puritani di Vincenzo Bellini, fino a ruoli del repertorio lirico spinto, o drammatico, per Cavaradossi in Tosca, Don Alvaro La forza del destino di Giuseppe Verdi, Calaf nella Turandot pucciniana o lo Chenier in Andrea Chenier di Umberto Giordano. Ha avuto al suo attivo una notevole discografia, diretto dai principali direttori dell'epoca: Victor De Sabata, Tullio Serafin, Antonino Votto, fino a Herbert von Karajan. Le sue interpretazioni più apprezzate sono comunque state quelle dal vivo. Dagli anni settanta ha tenuto alcuni seminari, degli stage di canto e nel 1973, il cantante accompagnò Callas nell'ultima tournée mondiale della cantante greco-statunitense. Nel 1975, a Spoleto, ha tenuto un master per i vincitori del Concorso Nazionale di canto "A. Belli", firmando anche un'aria dell'opera La bohème.
Luciano Pavarotti ne ammirava la voce ed una volta raccontò “Il mio idolo è Giuseppe di Stefano, lo amai ancor più di Beniamino Gigli e questo mi costò addirittura, per l'unica volta in vita mia, uno schiaffo da mio padre, che continuò a preferirgli Beniamino Gigli”. Giuseppe Di Stefano fu sì un tenore lirico, ma dalla passionalità e carnalità squisitamente siciliana, indimenticabili e di ineguagliato livello sono le sue “Cavallerie Rusticane” e i suoi “Pagliacci”.